摘要：爲了解四川省兔出血症病毒2型（rabbit友理 hemorrhagic disease vi行兒rus type 2，RHDV2）的流行情況及站輛分子遺傳變異特征，采集全省範圍内的7 525份樣(y黃商àng)品，其中發(fā)病兔場肝髒組訊公織樣(yàng)品117份、環境拭子樣(yàng)品243份，受監測兔場血光相液樣(yàng)品3 340份、環境拭子樣(yàng)品女船3 825份，采用商品化熒光RT-PCR試劑盒，對(d外暗uì)以上樣(yàng)品進(jìn)行RHDV2檢測；對(d計友uì)篩選出的12份肝組織陽性樣(黃外yàng)品進(jìn)行RHDV2 錢這VP60基因RT-PCR擴增、測序和遺傳進(jìn)化樹我分析。結果顯示：RHDV2流行電拿無明顯季節性，各養殖品系家兔均有睡術RHDV2感染，哺乳仔兔、幼兔、懷西作孕哺乳母兔死亡率分别爲25%~60%、18%~45%、9%~30聽懂%。發(fā)病兔場肝髒樣(yàng)品RHDV2陽性檢出率爲88.身用89%（104/117），環境樣(yàng)品爲46.09%（112/船紅243）；受監測兔場全血樣(yàng)品RHDV2陽性檢出率爲25.99%刀對（868/3340），環境樣(yàng)品爲16.29%（話男623/3825）。12份陽性樣(yàng)品的RHDV2 VP為什60基因序列長(cháng)度均爲1 740微玩 bp，核苷酸序列同源性爲98.4%~100%家兒，在系統發(fā)生進(jìn)化樹上獨成(chéng)讀刀一簇；與國(guó)内外參照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性爲呢議93.7%~100%，編碼的氨基酸序列同源性爲95.7%~日紙99.8%。結果表明：RHDV2已開(kāi)始在四川省流行，需要加強檢疫，重筆如視飼養管理工作；其VP60基因序列出現了一聽睡定程度的變異，但遺傳演化相對(duì少拿)穩定。本研究補充了國(guó)内RHDV2的看器分子流行病學(xué)信息，也爲該病的相關防控研究年訊和控制對(duì)策制定提供了事照參考。

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，不喝RHD）俗稱兔瘟，是兔的一種(zhǒng)急性快鐘、高度緻死性傳染病。RHD因潛伏期短、發(慢線fā)病急、病程短、傳播快、死亡率女老高（可達100%），被(bèi)我國(guó男哥)列爲二類動物疫病。該病典型病變特征是呼吸系統出血，實質器黑遠官淤血、腫大、出血，肝髒壞死，由嵌杯病毒科（Cali報知civiridae）兔病毒屬（Lag地關ovirus）兔出血症病毒（r著商abbit hemorrhagic少和 disease virus，RHDV）感染引起(qǐ)。根據感音章染的RHDV基因型不同（RHDV GI.1~4），RHD可分來雜爲RHD1型（經(jīng)典型）和RH看高D2型兩(liǎng)種(zhǒng)。自哥其中，RHD1型曾在世界很多國(guó)家發(fā)生和流行，但随著(zhe鐵紙)免疫接種(zhǒng)等防控措施的實施，RHD1的流行得到基本控說車制。RHD2型由RHDV GI.2基因型毒株（以下稱RHDV電請2）感染引起(qǐ)，2010年由法國(guó)首次報道(dào)。2020道月年以前，RHD2主要在歐洲一些國(guó)家發(fā)生，之後(hòu)出技雜現在非洲國(guó)家以及美洲的美國(guó)和墨西哥，呈現蔓延趨勢。2020視路年4月我國(guó)四川省金堂縣首次發(fā)生RHD2疫情訊要，平均死亡率爲42.85%，共撲殺銷毀家兔3 500森數餘隻，給養殖戶帶來較大經(jīng)濟損失。國(guó)家道内目前沒(méi)有預防RHD2的疫苗，也無有效的治療藥物可用，事用因而該病嚴重威脅著(zhe)養兔業健康發(f務不ā)展。

爲了解四川省RHDV2的流行情況、分子藍紅流行病學(xué)特征和遺傳變異規律，本研河朋究于2020—2021年對(duì)四川省兔場進(jì秒算n)行了流行病學(xué)調查，采用熒光RT-PCR方法，對(duì物吧)發(fā)病兔場的360份樣(yàng)品（117份病死兔肝髒從做組織樣(yàng)品、243份兔場環境拭子玩我樣(yàng)品）和705個受監測兔場的7 165份樣(y懂靜àng)品（3 340份全血樣(yàng)品及3 8得化25份環境拭子樣(yàng)品）進(jì靜著n)行了RHDV2核酸檢測，篩選出12份來自不同地區發(fā)病兔場的病原秒算核酸陽性樣(yàng)品；設計合成(chéng)2對(duì姐銀)RHDV2 VP60基因特異性引物，通過(guò)常規分子生木腦物學(xué)技術，對(duì)12份RH月飛DV2核酸陽性樣(yàng)品進(jì見舊n)行了VP60基因擴增測序和遺傳變異看又分析，以期爲有效控制RHD2型疫情在四川省的蔓延及其控制兵筆對(duì)策制定提供參考。

毒株、菌種(zhǒng)及試劑

2×Taq PCR Master近友 mix、瓊脂粉和TIANgel Midi Purifica話畫tion Kit（DP209）著員等，購自成(chéng)都(dōu)安雅生物試劑裡做有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購自成(chéng)都(dō要離u)大連寶生物科技有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒（4.0），購自這去西安天隆科技有限公司；RHD2型熒光RT-PCR檢測試作謝劑盒，購自四川博策檢測技術有限公司；EVO M-M如謝LV反轉錄試劑預混液試劑盒，購算微自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

樣(yàng)品來源

受檢樣(yàng)品共計7 525份。其中：360份來自發(f月線ā)病兔場，包括117份病死兔肝髒組織樣(yàng你冷)品和243份發(fā)病兔場自中環境拭子樣(yàng)品，采自12個地市18個縣區25個發(fā)病公我兔場（表1）；7 165份血液湖高及環境拭子樣(yàng)品，采自受舊雪監測的705個規模兔場，包括2020年在全省所有地市門家432個集中監測規模兔場采集的全血樣(yàng)品2 080份、兔場環境樣路謝(yàng)品2 345份，202匠科1年在全省12個地市273個集中監測規模兔從科場采集的全血樣(yàng)品1 260份、兔場環朋山境樣(yàng)品1 480份。

樣(yàng)品采集

肝髒組織樣(yàng)品：對(duì)病死兔時離解剖，無菌采集肝髒組織，-20 ℃凍存備用；環境棉拭子：理理采集兔養殖場地面(miàn)、圈舍、食槽、排洩物等環境樣(yàng)品，資開置于PBS緩沖液中，-20 ℃凍存備用。受監測兔場采樣(yàng)光厭原則：存欄500隻及以上的規模兔場，每個兔場至少采集10份全血樣空遠(yàng)品和10份環境樣(yàng)品；50要歌0隻以下的兔場，采集5份全血樣(y暗關àng)品和5份環境樣(yàng)品。以上樣(yàng)資術品均由四川省動物疫病預防控制中心收集保存。 

發(fā)病兔場流行病學(xué)調查

統計發(fā)病兔場發(fā)病時(shí)間、地點、家兔品系、存欄遠熱量、死亡率等基本信息，分析RHD2的發(fā)生與數都季節、品系等的相關性，統計不同生長(cháng)階段兔隻的死亡討腦率。

熒光RT-PCR檢測

將(jiāng)肝髒組織樣(yàng)品研磨勻漿，離心取上清大場，將(jiāng)環境拭子樣(yàng)品離心取上清，將(jiāng)地從全血樣(yàng)品直接取樣(yàng)，按常規方法司民進(jìn)行總RNA提取，使用RHD2型熒光RT-PCR檢測試劑盒進(j就對ìn)行檢測。

VP60基因擴增及測序

根據GenBank（http://www.ncbi.nlm.n她上ih.gov）中的RHDV2基因組序列，通過(guò)DNAs公樹tar和Premier 5.0軟件分析後紅快(hòu)，針對(duì)VP60基因片段設計2對(duì)特異性引物還空（表1）。引物由成(chéng)都(dō熱村u)擎科生物有限公司合成(chéng)，按照合成(ch人音éng)說(shuō)明書將(jiāng)其稀他秒釋至10 μmol/L，-20 ℃凍存備用。

將(jiāng)經(jīng)熒光R雪地T-PCR檢測篩選出的12份來自不同地區發(fā)病兔場的R了資HDV2核酸陽性肝組織樣(yàng)品，提取這醫總RNA，根據EVO M-MLV反轉錄試劑雪煙預混液試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉錄操作，以反轉媽玩錄産物（cDNA）爲模闆，分别以P1/P2、P3/P4爲引物，畫森進(jìn)行RHDV2 VP60兩(liǎng)段基因的PCR擴增，答她反應結束後(hòu)取5 μL産物進站土(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。純化回收PCR産物，由成資森(chéng)都(dōu)擎科那民生物有限公司進(jìn)行序列測定，用DNAstar軟車黑件拼接後(hòu)進(jìn)行測序結果的Blast分析。

VP60基因序列分析

使用DNAstar等軟件分析擴增測序的R購雪HDV2 VP60基因序列的結構組成(chéng)特征，收集Gen線區Bank中的國(guó)内外14條不同基因型的RHDV 間木VP60基因序列和10條RHDV2 VP60序列進(長和jìn)行RHDV2 VP60基因的核苷酸及其編物關碼氨基酸的同源性分析，同時(shí)繪制VP60基草南因序列系統進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳變異分析。

發(fā)病兔場流行病學(xué)調查

經(jīng)過(guò)對(du空大ì)發(fā)病兔場的流行病學(xué)調查可知：RHD開跳2流行無明顯季節性；伊拉配套系、新西蘭兔、伊普呂配套系、伊看購高樂配套系等多個品系家兔均有發(fā)病區但；哺乳仔兔死亡率爲25%~60%，部分呈現整窩死紙弟亡，幼兔死亡率爲18%~45%，懷孕哺乳母兔死亡率爲9%近快~30%。具體情況見表2。

熒光PCR檢測

發(fā)病兔場　2020—2021年，累計檢測發(裡多fā)病兔場117份肝髒組織樣(yàng)品及243份環境樣鐵資(yàng)品，檢出肝髒組織陽性樣(yàng)品104份，陽性檢出率紅員爲88.89%，檢出兔場環境陽性樣(yàng)品112份農議，陽性檢出率爲46.09%。部分RHD行醫V2熒光RT-PCR檢測結果見圖1。

受監測兔場　2020年共檢測全血樣(yàn笑樂g)品2 080份，陽性檢出率爲14報知.18%，檢測環境樣(yàng)品2 345份，陽性檢出率爲10.習靜28%；涉及規模場432個，場點陽性檢出率爲8.56%，2021年共檢暗些測全血樣(yàng)品1 260份，陽性檢出率爲45.48%，檢測環境樣(弟算yàng)品1 480份，陽性檢出率25.81%；涉及規模場273個，場影房點陽性檢出率爲39.93%。全血樣(yàng)品總體陽們公性檢出率爲25.99%（868/3 340外來），環境樣(yàng)品總陽性檢出率爲16.29%（6讀妹23/3 825）。具體統計結果見表3。

VP60基因RT-PCR檢測

分别以P1/P2、P3/P4爲引物，對(du化相ì)抽提的12份RHDV2陽性病料中的VP60基因不同片段進(jìn)行R畫跳T-PCR擴增，結果如圖2-A和圖2-B所示。每份R子事HDV2都(dōu)擴增出約1 095 bp和1 117 bp預期大請讀小的兩(liǎng)條特異性DNA條帶（即VP60a和VP6暗拍0b片段），陰性對(duì)照了多樣(yàng)品無擴增。

VP60基因測序鑒定

分别對(duì)12份RHDV2陽性樣(yàng)品的VP自生60基因不同片段進(jìn)行純化回收及序列測定，將(jiān可上g)測序結果拼接後(hòu)進(jìn)行Blast分析。結果顯示，12條擴增村吧序列與GenBank中RHDV2毒株的同源性均在97%以上，一妹表明成(chéng)功擴增出了12份陽性樣(yàng)年視品的RHDV2 VP60基因序列。通哥土過(guò)DNAstar軟件進(jì離東n)行VP60編碼框（ORF）序列整理，分别編号爲SCh202001—S光志Ch202012。 

VP60基因序列特征

采用DNAstar生物學(xué)信息土房軟件MegAlign程序進(jìn)行12份陽性樣(yàn吃作g)品的RHDV2 VP60基因序列特征分析中謝，結果受檢的12份陽性樣(yàng)品的R術綠HDV2 VP60基因序列長(cháng)均說他爲1 740 bp，編碼579個氨基酸。12份陽性樣(y鐘和àng)品的RHDV2 VP60基因序列在第18、24、99、刀時105、114、132、213、25近睡2、321、330、363、378、39他近9、568、612、705、723、741、765、804、8事花28、882、885、930、1 026、水理1 056、1 089、1 095、1 155、1 156、1 165、1 現畫227、1 231、1 242、1去技 284、1 317、1 551、1習朋 576、1 608、1 618和1 62章歌2 bp共41處核苷酸存在突變，核苷酸序列報電同源性爲98.4%~100%，其中114、睡多1 156、1 165、1 2森些31、1 576、1 618和1 622 b資劇p 等7處爲錯義突變，其他34處均爲同義突變，且SCh數開202004和SCh202005、SCh2020街家07和SCh202009同源性爲100%，表明12份鐘自陽性樣(yàng)品的RHDV2 VP60基因遺傳相對(duì)穩定。

VP60基因同源性分析

通過(guò)DNAstar軟件與藍頻GenBank中的10條RHDV2毒株VP60參考序列（表2這們）進(jìn)行同源性分析，發(fā)現22條VP60基因序列村電核苷酸同源性爲93.7%~100%，其中Sch202010嗎暗與2020年新加坡RHDV2分離株GI.2/S工什G-NParks 2020/M得西54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）；推導的對(duì)應氨少開基酸序列同源性爲95.7%~99.8%雜藍，其中SCh202002、SCh2著國02003、SCh202004、SCh202005和SCh購分202006與2010年法國(g購玩uó)RHDV2分離株10-32（HE800532）同源性最國家低（95.7%），而Sch202010與2020年新加坡RHDV2 分離株現不GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）推導民山氨基酸同源性最低（97.2%）。結果這不表明，12份陽性樣(yàng)品的RHDV2 體了VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相近冷比出現了一定程度變異，但仍相對(duì)穩定。

VP60基因遺傳演化分析

通過(guò)DNAstar軟件對(duì)12份陽性樣(河錯yàng)品的RHDV2 VP60基因序列與國(guó短妹)内外14條不同基因型的RHD還友V VP60序列和10條RHDV2 這美VP60序列進(jìn)行核苷酸比較，繪制系統發(fā)生進(jìn很花)化樹（圖3）。經(jīng)黃也典型RHD毒株（GI.1毒株）和RHDV2毒株形成(chéng玩紙)兩(liǎng)個大分支：參考的經(jīng)典型RHD毒株又分爲2個物鐘分支，國(guó)内的經(jī舊海ng)典型RHD株分别處在不同分支；RHDV2毒株也可分爲2個分支行鐵，12份陽性樣(yàng)品的RHD西我V2 VP60序列和我國(guó)2020年RHDV2 SC20家的20-04株（MT383749）單獨成(chéng)簇，與Sweden 訊紙2018年分離株2381（MH341513）在一個分支，與新加坡草音RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 20我又20/M54-9（MW194928）處于不同分支。結果表校空明，RHDV2毒株VP60基因序列遺傳演化可能(néng)理冷會(huì)呈現複雜化趨勢，目前仍相對(duì)穩定。答美

2010年法國(guó)報道(dào)出現RHD2後(hòu)，意木得大利、西班牙、德國(guó)、葡萄牙、英國(guó)、相公挪威等多數西歐國(guó)家和亞速爾群島，冷房以及北非和南非一些國(guó)兒鐵家陸續報道(dào)了該病的發(著短fā)生，2019—2020年美國(g媽雨uó)、墨西哥、日本、中國(guó)和菲律賓報道(dào)發(fā)生該亞型疫算從情，RHD2疫情流行速度快，暴發(fā)範圍廣，呈現吧窗出替代經(jīng)典型RHD（RHD1）趨勢。

本研究通過(guò)流行病學(xué)調查發(fā)也信現，RHD2流行無明顯季節性，常見的品系家兔均有發(fā)病畫劇，其中伊拉配套系發(fā)病死亡率較高，乳兔化姐和幼兔死亡率高于成(chéng)兔，這(zhè)與國(guó)外相關報道(d什草ào)一緻。樣(yàng)品檢測結果顯示，發(fā)病兔場和受讀錯監測兔場的環境樣(yàng)品陽性率在16.29%以上，提示RH綠冷DV2傳播潛力強大，加強飼養管理和做好(外舞hǎo)消毒等的日常預防具有重要意義輛和。

據相關報道(dào)，我國(g森船uó)首次發(fā)生RHD2疫情的兩(影文liǎng)個兔場的RHDV2 VP60基因片段核苷酸草爸同源性爲99.1%，與RHDV2參考毒株的同源性爲94.1%~98.就章3%，屬于同一分支上，與經(jīng)典型RHD毒株的同源性爲79.0%~80用山.0%，親緣關系較遠。爲進(jìn)一步了解其分子流行裡區特點，本研究對(duì)12份陽性年線樣(yàng)品的RHDV2 VP60基因全序列進(jìn)行了克隆分析文長。作爲RHDV的主要結構蛋白，VP60蛋白的氨基酸序列可分身道爲A（1~21）、B（22~300）、C（301~328）、D（3街為29~343）、E（344~434）和F（43樂器5~580）6個區，通過(guò)折疊成見西(chéng)内殼（S-shell區）和外殼（P那嗎2區）兩(liǎng)個主要的緊湊區域構成(chéng)衣殼，其懂做中N端的A和B區組成(chéng)内殼區，C端的C、D、E、F雜聽區組成(chéng)外殼區，分别位于N端第3l~250位和C端理你第477~579位氨基酸之間的主要抗原區域。本研究表明，受試的12份R光見HDV2 VP60基因核苷酸序列有41處突變，含34處同義突變和女土7處錯義突變，即VP60蛋白的B（22雪也~300）1處、E（344~434）2處和F（435~580）3處錯義突看河變。這(zhè)一點與金明蘭等研究RHDVYL毒國討株VP60基因遺傳演變分析時(shí)得出的VP60蛋白A、B、D票紙、F區變異相對(duì)較低、C、E區變異較高的結論存在一定光朋差異，這(zhè)需要在更多RHDV2銀在 VP60序列的變異分析上進(jìn)一步驗證，當然這(zhè)也可能(n如空éng)是RHDV2毒株遺傳變異的特點。校行雖然目前12份RHDV2 VP60基因的遺傳演變相對(duì)穩定，廠分但仍需要警惕較大變異幅度的毒株出現。

通過(guò)DNAstar軟件對(duì)12份陽性樣(yàng)品的RH到老DV2 VP60基因序列與國(guó)内外14條不同基因型的醫煙RHDV VP60序列和10條木雜RHDV2 VP60序列繪制系統發(fā)生進(jìn)弟服化樹，發(fā)現12份RHDV2 VP60序員黃列和我國(guó)2020年RHDV2 SC2020-04株（MT38374靜務9）單獨成(chéng)簇，與風子Sweden 2018年分離株2381（MH341513）參考靜樂序列同源性較高；RHDV2毒株VP60序列同源性分析發(fā)現，RH知見DV2 VP60基因序列核苷酸同源性爲93.7%~100%，其中Sch2020筆北10與國(guó)外毒株GI.2/件船SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93短日.7%），但是12份陽性樣(yàng房答)品的RHDV2 VP60核苷酸序列同源性爲98.4河唱%~100%，這(zhè)都(dō來鄉u)表明12份陽性樣(yàng)品站秒的RHDV2 VP60基因與國(guó)外早期和最近毒問美株相比出現了一定程度變異，但遺傳相對(duì)穩定，同時唱做(shí)也提示目前我國(guó)RHDV2毒株V文問P60基因比較保守且可能(né服雜ng)存在區域性特點。需要注意的是，本研究克隆分析用的著慢RHDV2毒株均爲同一時(shí)頻相期的毒株，通過(guò)系統發(fā)生進(jìn)化樹發(fā)現，國商文(guó)内RHDV毒株流行時(shí)期不分放同，分支也不同，提示RHDV2毒株在我國(gu嗎章ó)很可能(néng)随著(zh了志e)時(shí)間和地區的改變出現新的變異現象。河報

本研究對(duì)四川全省1年多時(年花shí)間的RHDV2流行情況進(jìn)行調查和統嗎湖計分析，對(duì)RHDV2基因序列信息進(jìn)行收集比對(duì)，嗎冷對(duì)12份RHDV2 VP6醫子0基因進(jìn)行了克隆測序和遺傳變異分析，發(fā)現RHDV2已白技經(jīng)在四川省多個地市存在，其VP60基因北訊序列出現了一定程度的變異，但遺鄉計傳演化相對(duì)穩定，RHDV2毒株單現朋獨成(chéng)簇。本研究補充了國(guó)内RHDV2的分子下人流行病學(xué)信息，也爲RHD2相關防控研究和控制對(duì)策制定提供數見了參考。