摘要：爲了解四川省兔出血症病毒2型（rabbit hemorrh分視agic disease virus type 2，RHDV2）的流行情況及為新分子遺傳變異特征，采集全省範圍内的7 525份樣(yàng技他)品，其中發(fā)病兔場肝髒組織樣(yàng)品117份、環境河報拭子樣(yàng)品243份，受監測兔場血液自什樣(yàng)品3 340份、環境拭子樣(yàng)品3線木 825份，采用商品化熒光RT-照日PCR試劑盒，對(duì)以上樣(yàng)品進(jìn)行RHDV2檢測；但城對(duì)篩選出的12份肝組織陽性樣(yàng)品進站你(jìn)行RHDV2 VP60基因R黃離T-PCR擴增、測序和遺傳進(們銀jìn)化分析。結果顯示：RHDV2流行無明顯季節北錢性，各養殖品系家兔均有RHDV2感染，哺乳仔兔、幼兔、懷孕哺乳母兔死睡家亡率分别爲25%~60%、18%~45%、朋窗9%~30%。發(fā)病兔場肝髒樣(草樹yàng)品RHDV2陽性檢出率爲88.89%（104/117）票街，環境樣(yàng)品爲46.09%（呢吃112/243）；受監測兔場全血樣(yàng)品RHDV2年腦陽性檢出率爲25.99%（868/3340），環境樣(yàn好大g)品爲16.29%（623/3825）。12份陽票些性樣(yàng)品的RHDV2 VP60基因序列長(cháng)如報度均爲1 740 bp，核苷酸序列同源性爲98.4%~100%，在技現系統發(fā)生進(jìn)化樹上獨成(chéng)一簇；與國(guó)店志内外參照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性爲93.7%~100%，編碼的氨基喝得酸序列同源性爲95.7%~99.8%。結果表明：RHDV2已開(kāi個可)始在四川省流行，需要加強檢疫，重視飼養管理工作；其V公唱P60基因序列出現了一定程度的變異，但遺傳演化相對(duì)工劇穩定。本研究補充了國(guó)内RHDV2的分子流行病學(xué)信息吧下，也爲該病的相關防控研究和控制對(duì)策制定提供了參考。兔年這病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disea兒習se，RHD）俗稱兔瘟，是兔的一種(zhǒng)急性、高生的度緻死性傳染病。RHD因潛伏期短、發(fā)病急、病程路紙短、傳播快、死亡率高（可達100%），被(bèi)我國(guó)列爲二類動物頻通疫病。該病典型病變特征是呼吸系統出都離血，實質器官淤血、腫大、出血，肝髒壞死，由嵌杯病毒科（Cal務河iciviridae）兔病毒屬（河技Lagovirus）兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic 音北disease virus，RHDV）感染引起(qǐ)。根據感染的RHDV基因分件型不同（RHDV GI.1~4），RHD可分爲RHD1型但熱（經(jīng)典型）和RHD2型兩(liǎng)種(zhǒng)遠現。其中，RHD1型曾在世界很多國(gu線制ó)家發(fā)生和流行，但随著(zhe)免疫接種(zhǒng)等防控區生措施的實施，RHD1的流行得到樹物基本控制。RHD2型由RHDV GI.2基因型毒株（以下稱慢樹RHDV2）感染引起(qǐ)，2010年由法國(guó)首次報南船道(dào)。2020年以前，R笑海HD2主要在歐洲一些國(guó)家發(fā)生，之後(老紅hòu)出現在非洲國(guó)家以及美洲的美國(購黃guó)和墨西哥，呈現蔓延趨勢。2020年亮亮4月我國(guó)四川省金堂縣首次發(f船近ā)生RHD2疫情，平均死亡率爲42.85%，共撲殺銷毀家兔些是3 500餘隻，給養殖戶帶來較大草就經(jīng)濟損失。國(guó)内目前沒(méi)有預高費防RHD2的疫苗，也無有效的治療藥物可用，因而該制森病嚴重威脅著(zhe)養兔業健康發(fā)展。爲了解她樂四川省RHDV2的流行情況、分子流行病學(xué)特征和遺傳體睡變異規律，本研究于2020—2021年對(duì)四川省兔場進(j明化ìn)行了流行病學(xué)調查，采用熒光RT-PCR方法，對土那(duì)發(fā)病兔場的360份樣(yàng)品（個票117份病死兔肝髒組織樣(yàng)品、243理東份兔場環境拭子樣(yàng)品）和705個受監測兔場的7 165份樣(哥日yàng)品（3 340份全血樣(yàng)品及3 825城書份環境拭子樣(yàng)品）進(jìn)行了RHDV2核酸檢測，篩選出12份來來美自不同地區發(fā)病兔場的病原核酸陽性樣(秒森yàng)品；設計合成(chéng)2對(duì)RHDV2 VP60基因特銀輛異性引物，通過(guò)常規分子生物學(xué船能)技術，對(duì)12份RHDV空玩2核酸陽性樣(yàng)品進(jìn)行南請了VP60基因擴增測序和遺傳變異分析，以期爲有效控制RHD2型疫情在四川省的不錯蔓延及其控制對(duì)策制定提供參考。材料與方法毒株、菌種(zhǒng理行)及試劑2×Taq PCR Maste相習r mix、瓊脂粉和TIANgel Midi Purification Ki林我t（DP209）等，購自成(chéng)都(dōu)安雅生物試劑有限公司；DL東時 2 000 DNA Marker，購自成姐火(chéng)都(dōu)大連寶生物科技有限公司；病毒DNA/RNA器暗提取試劑盒（4.0），購自西安天隆科技有限公紅煙司；RHD2型熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自四川博策檢測技術有限公司；EV學動O M-MLV反轉錄試劑預混液試劑盒，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。樣(yà習不ng)品來源受檢樣(yàng)品共計7 525份。其中：3裡他60份來自發(fā)病兔場，包括117份病死兔肝髒組織樣(yàng)品和243姐北份發(fā)病兔場環境拭子樣(yàng)品，采自1醫中2個地市18個縣區25個發(fā)病兔場（表1有他）；7 165份血液及環境拭子樣(yà爸麗ng)品，采自受監測的705個規模兔場，包括數站2020年在全省所有地市432個集店草中監測規模兔場采集的全血樣(yàng)品2 080份、兔場票著環境樣(yàng)品2 345份，2021年在全省看舞12個地市273個集中監測規模兔場采集的全血樣(yàng)品1 2村如60份、兔場環境樣(yàng)品1 480份下報。樣(yàng)品采集肝髒組織樣(yàng市報)品：對(duì)病死兔解剖，無菌采集肝髒組織，-20 ℃凍存備用；環境棉拭自相子：采集兔養殖場地面(miàn)、圈舍、食槽、排飛門洩物等環境樣(yàng)品，置于PBS緩沖液中，-20 ℃凍存頻水備用。受監測兔場采樣(yàng)原則：存欄500隻及以上的規模兔業河場，每個兔場至少采集10份全血樣(yàng)品和10份環境劇短樣(yàng)品；500隻以下的兔場，采集5份全血樣(yàng)品和電市5份環境樣(yàng)品。以上子議樣(yàng)品均由四川省動物疫病預防控制綠中中心收集保存。 發(fā)病兔場流行病學(xué)調查統計發(fā間線)病兔場發(fā)病時(shí)間、地點、家兔品系、存欄量、制得死亡率等基本信息，分析RHD2的發(fā)生與大劇季節、品系等的相關性，統計不同生長(cháng)階段兔隻的生司死亡率。熒光RT-PCR檢測將(jiāng)肝髒組織樣(yàng)品研磨花知勻漿，離心取上清，將(jiāng)環境拭子樣(yà錯做ng)品離心取上清，將(jiāng)全血樣(yàng)品直接取樣(好呢yàng)，按常規方法進(jìn)行總RNA提取，使用雪跳RHD2型熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行檢測。V媽視P60基因擴增及測序根據GenBank（http://www為書.ncbi.nlm.nih.gov）中的RHDV2基因組序列，通過(gu計你ò)DNAstar和Premier 5姐業.0軟件分析後(hòu)，針對(duì)VP鐘如60基因片段設計2對(duì)特異性引物（表1）。市務引物由成(chéng)都(dōu)坐文擎科生物有限公司合成(chéng)，按照合成(chéng答要)說(shuō)明書將(jiāng)其稀釋至麗有10 μmol/L，-20 ℃凍存備美服用。將(jiāng)經(jīng)熒光RT-PCR檢測篩物民選出的12份來自不同地區發(fā)病兔場的RHDV2核酸陽性肝組織樣(yàn長那g)品，提取總RNA，根據EVO M-MLV反轉錄試劑預畫金混液試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反河機轉錄操作，以反轉錄産物（cDNA）爲模闆，分别以P1/P2、P3/P4爲火長引物，進(jìn)行RHDV2 VP60兩(liǎng)段基因的PCR擴增議地，反應結束後(hòu)取5 μL産物進(jìn)行1.0%鐵上瓊脂糖凝膠電泳分析。純化回收PCR産物，由山訊成(chéng)都(dōu)擎志劇科生物有限公司進(jìn)行序列測定，用他火DNAstar軟件拼接後(hòu)進(j湖厭ìn)行測序結果的Blast分析。VP60基因序列分析使用DN看去Astar等軟件分析擴增測序的RHDV2 VP60基因序列的上兵結構組成(chéng)特征，收集GenBank中的國(guó)内外14條不但金同基因型的RHDV VP60基因序列和10條RHDV2 V放玩P60序列進(jìn)行RHDV2 VP60基因的核苷酸及家現其編碼氨基酸的同源性分析，同時(s日器hí)繪制VP60基因序列系統進(jìn美我)化樹進(jìn)行遺傳變異分析。結果與分析發(f他短ā)病兔場流行病學(xué)調查經(jīng)得資過(guò)對(duì)發(fā)病兔場的流行病學(xué)調查可知：R樹森HD2流行無明顯季節性；伊拉配套系、新西蘭兔、伊普呂配套系、伊高樂配套系等多知自個品系家兔均有發(fā)病；哺乳仔兔死亡率爲25%~60新站%，部分呈現整窩死亡，幼兔死亡率爲18%~45%，懷孕哺乳母兔外喝死亡率爲9%~30%。具體情況見表2。熒光PCR檢測發(fā)病兔場 20機少20—2021年，累計檢測發(fā)病兔場117份肝髒組織樣(yà街裡ng)品及243份環境樣(yàng)品，檢出肝髒組織陽性樣(yàng)品1能時04份，陽性檢出率爲88.89%，檢出兔場環境陽性銀但樣(yàng)品112份，陽性檢出率爲46子笑.09%。部分RHDV2熒光RT-PCR檢測結果見圖1。受監測兔場 202問司0年共檢測全血樣(yàng)品2 080份，陽性檢出率爲1鐵拿4.18%，檢測環境樣(yàng)品2 345份，陽性檢出率爲10.28%；志理涉及規模場432個，場點陽性檢出率爲8.5就購6%，2021年共檢測全血樣(yàng)品中拿1 260份，陽性檢出率爲45.48器醫%，檢測環境樣(yàng)品1 480份，陽性檢出率25.81%討短；涉及規模場273個，場點陽性檢出率爲39.93%。全血樣(yàng)品家金總體陽性檢出率爲25.99%（868/3 拍熱340），環境樣(yàng)品總陽性檢出率爲16.29%（62農線3/3 825）。具體統計結果見表3。VP60基因RT會鐘-PCR檢測分别以P1/P2、P3/P4爲引物，對(duì)抽提的12開窗份RHDV2陽性病料中的VP60基因不同片段進(jìn)行RT-P長吧CR擴增，結果如圖2-A和圖2-B所示。每報金份RHDV2都(dōu)擴增出約1 095 bp和1 117 bp預期南資大小的兩(liǎng)條特異性DNA條帶（即VP60a和VP60b片段靜頻），陰性對(duì)照樣(yàng)品無擴增。VP60基因測序鑒定分别對微計(duì)12份RHDV2陽性樣(yàng)品的VP60基因不同片段麗湖進(jìn)行純化回收及序列測定，將(jiān知離g)測序結果拼接後(hòu)進(jìn)行Blast分析。結果說對顯示，12條擴增序列與GenBan通冷k中RHDV2毒株的同源性均在97%以上，表明海吃成(chéng)功擴增出了12份陽性樣(yàng)品的RHDV2 請日VP60基因序列。通過(guò)DNAstar軟件進(jì上生n)行VP60編碼框（ORF）序列整朋說理，分别編号爲SCh202001—SC志些h202012。 VP60基因序列特征采用DNAstar生物農分學(xué)信息軟件MegAlign程序進(jìn)行12份陽性樣(yàng)哥笑品的RHDV2 VP60基因序列特征分析，結果受檢的12很醫份陽性樣(yàng)品的RHDV2 VP60能裡基因序列長(cháng)均爲1 740 bp，員好編碼579個氨基酸。12份陽性樣(y訊黃àng)品的RHDV2 VP60年河基因序列在第18、24、99、10長現5、114、132、213、2討的52、321、330、363、378、399開影、568、612、705、723、741、765雪作、804、828、882、885、930、1 0制店26、1 056、1 089、有南1 095、1 155、1 156、1 165、兒子1 227、1 231、1 242、1 284、1 317、1 551請草、1 576、1 608、1 618和1 622 bp共41處核苷酸存下跳在突變，核苷酸序列同源性爲98.4%~100%，其中114、暗聽1 156、1 165、1 231、1 576、1 618和銀冷1 622 bp 等7處爲錯義突變，其他34處均爲同慢商義突變，且SCh202004和SCh202005、SCh2唱那02007和SCh202009同源性爲100現有%，表明12份陽性樣(yàng錯他)品的RHDV2 VP60基因遺傳相對(duì)穩定。VP草這60基因同源性分析通過(guò)DNAstar軟件與GenBank中的10音這條RHDV2毒株VP60參考序列（表2）技就進(jìn)行同源性分析，發(fā)現22條VP60基因序列核苷鐵靜酸同源性爲93.7%~100%，其中Sch校在202010與2020年新加坡RHDV2分離株GI.2/S機劇G-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（工志93.7%）；推導的對(duì)應氨基酸序列同源性城明爲95.7%~99.8%，其中SCh202002、S錢煙Ch202003、SCh202004、SCh202005和SCh202006與站空2010年法國(guó)RHDV2分離株10-32（HE800532）同源歌民性最低（95.7%），而Sch202010與2020年新加坡R玩微HDV2 分離株GI.2/SG-NPar和弟ks 2020/M54-9（MW1949日頻28）推導氨基酸同源性最低（97.2%）。結果表明，12份陽性樣(yàng)河我品的RHDV2 VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相比出現樹海了一定程度變異，但仍相對(duì)穩定。VP60基很妹因遺傳演化分析通過(guò)DNAstar軟件對(d新一uì)12份陽性樣(yàng)品的RHDV業子2 VP60基因序列與國(guó)内外14條不同基因型的熱火RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60序列進(jìn)行核苷酸下空比較，繪制系統發(fā)生進(服木jìn)化樹（圖3）。經(jīng)空船典型RHD毒株（GI.1毒株）和RHDV2毒株形成(chéng)兩(l事場iǎng)個大分支：參考的經(jīng)典型RHD毒株又分爲2個分快生支，國(guó)内的經(jīng)典型RHD株分别處在不同分呢相支；RHDV2毒株也可分爲2個分支，12份湖雨陽性樣(yàng)品的RHDV2 VP60序列和我裡是國(guó)2020年RHDV2 頻空SC2020-04株（MT383749）單獨成(少議chéng)簇，與Sweden 2018年計睡分離株2381（MH341513）在一水謝個分支，與新加坡RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 2020從城/M54-9（MW194928）處于不同分支。結果表明，RHDV2看很毒株VP60基因序列遺傳演化可能(néng)會(huì)呈現複雜化趨勢快生，目前仍相對(duì)穩定。讨論2010年法國(guó)報花裡道(dào)出現RHD2後(hòu)，意大利、西班牙、德國(guó)匠匠、葡萄牙、英國(guó)、挪威等多數西歐國(guó)家和亞速爾群島，以跳會及北非和南非一些國(guó)家陸續報道(dào)了該病的發那近(fā)生，2019—2020年美國(gu車市ó)、墨西哥、日本、中國(guó)和菲律賓報道(dào)發(fā)生該亞型還習疫情，RHD2疫情流行速度快，暴發(fā)範圍廣，呈現出替代經(jī麗見ng)典型RHD（RHD1）趨勢。本研究通過(guò)流行病冷通學(xué)調查發(fā)現，RHD2公林流行無明顯季節性，常見的品系家兔均有發(f秒又ā)病，其中伊拉配套系發(fā)病死亡率較高，乳冷筆兔和幼兔死亡率高于成(chéng)兔，這(zhè)與國(guó)外相關報道(d民紅ào)一緻。樣(yàng)品檢可紅測結果顯示，發(fā)病兔場和受監測兔場的環境樣(y錢山àng)品陽性率在16.29%以上，提示RHDV2傳播潛力強離多大，加強飼養管理和做好(hǎo)消毒等的日常預防具有重要理白意義。據相關報道(dào)，我國(guó)首次發(fā)生動電RHD2疫情的兩(liǎng)個兔場的RHDV2 VP子制60基因片段核苷酸同源性爲99.1%，與RHDV2參考毒株的同源唱一性爲94.1%~98.3%，屬于同一分支上，離地與經(jīng)典型RHD毒株的同路公源性爲79.0%~80.0%，親緣關系較遠。爲進(jìn)西答一步了解其分子流行特點，本研究對(duì)12份陽性樣(yàn鐵錢g)品的RHDV2 VP60基因全序列進(jìn)行了克隆分東也析。作爲RHDV的主要結構蛋白，VP60蛋白的氨基酸序數一列可分爲A（1~21）、B（22~300）做做、C（301~328）、D（329~343）、E（3金相44~434）和F（435~580）6個區，通過(guò)計匠折疊成(chéng)内殼（S-shell電亮區）和外殼（P2區）兩(liǎng)個主要的緊湊區域構成(chéng)衣殼，玩亮其中N端的A和B區組成(chéng)内殼區，C端的C、D、和中E、F區組成(chéng)外殼區，分别位于N端第3l~250位和C端第時地477~579位氨基酸之間的主要抗原區域。本研究表明，受試的鐘視12份RHDV2 VP60基因核苷酸序列有41處突變，含34處同義突變和7處店通錯義突變，即VP60蛋白的B（22~300）1處、E（3唱暗44~434）2處和F（435~580）3處錯義突變。這(zhè)愛火一點與金明蘭等研究RHDVYL毒株VP60基因遺傳演變分析時(shí)得出錢唱的VP60蛋白A、B、D、F區變異相動船對(duì)較低、C、E區變異較高的結論存在一定差異，這(zh慢店è)需要在更多RHDV2 VP60時市序列的變異分析上進(jìn)一步驗證，當然這(喝子zhè)也可能(néng)是RHDV2毒株遺傳變異的特點。雖然目前12份知影RHDV2 VP60基因的遺傳演變匠筆相對(duì)穩定，但仍需要警惕較大變異幅街筆度的毒株出現。通過(guò)DNAstar軟件對(duì)12妹個份陽性樣(yàng)品的RHDV2 VP60基因序列與國(guó)内外14條子和不同基因型的RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60秒電序列繪制系統發(fā)生進(jìn)化樹，發(fā)現12份RHDV2 鐘短VP60序列和我國(guó)2020年RHDV2 SC202拍得0-04株（MT383749）單獨訊兒成(chéng)簇，與Swed明見en 2018年分離株2381（MH341513）參考序列同源性較高；RHDV理銀2毒株VP60序列同源性分析發(fā)現，技到RHDV2 VP60基因序列核苷酸同源性爲93.7%~100%，其中Sc可術h202010與國(guó)外毒株GI.2/SG-NParks 2姐購020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%），但是12份陽性腦水樣(yàng)品的RHDV2 VP6海民0核苷酸序列同源性爲98.4%~10朋動0%，這(zhè)都(dōu)表明12份陽性樣(yàn南化g)品的RHDV2 VP60基因與國(文藍guó)外早期和最近毒株相比出現了一定程坐拿度變異，但遺傳相對(duì)穩定，同物厭時(shí)也提示目前我國(guó)RHDV匠廠2毒株VP60基因比較保守且可能(néng)存在區域性特點。需件書要注意的是，本研究克隆分析用的RHDV2毒株均爲同一時(shí)期的毒株哥但，通過(guò)系統發(fā)生進(jìn)化樹發(fā也身)現，國(guó)内RHDV毒株舊筆流行時(shí)期不同，分支也不同，提示RHDV2毒株在我廠日國(guó)很可能(néng)随著(zhe)到這時(shí)間和地區的改變出現新的變異現象。本研究對(duì)四川全省拿月1年多時(shí)間的RHDV2流行情況進(jìn雜請)行調查和統計分析，對(duì)RHDV2基金快因序列信息進(jìn)行收集比對(duì)，對(duì)12份RHDV了去2 VP60基因進(jìn)行了克隆測序和遺傳變異分析，發(家放fā)現RHDV2已經(jīng)在四川省多個地腦遠市存在，其VP60基因序列出現了一定程聽街度的變異，但遺傳演化相對(duì)穩定，RHDV2毒株單獨成(chéng)簇不術。本研究補充了國(guó)内RHDV2的分子流用科行病學(xué)信息，也爲RHD2相關防控研究和控制對(du見知ì)策制定提供了參考。

2022-09-26